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Aug 03, 2023

デジタル PCR による非対象者の便サンプル中のサイトメガロウイルス (CMV) の検出

Giornale di virologia

Virology Journal volume 19、記事番号: 183 (2022) この記事を引用

1661 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CMV 胃腸炎は、同種造血幹細胞移植を受ける患者によく見られ、非常によく似た症状を持つが全く異なる治療が必要な急性移植片対宿主病 (aGvHD) と区別するのは困難です。 CMV胃腸炎は胃腸管における局所感染またはCMVの再活性化によって引き起こされますが、aGvHDは免疫拒絶によって引き起こされます。 CMV胃腸炎およびaGvHDの診断のゴールドスタンダードは、内視鏡下での胃腸生検ですが、これは侵襲的であり、重篤な副作用を引き起こす可能性があります。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) を使用した便サンプル検査が代替手段となる可能性がありますが、報告された研究では、微量レベルの測定と精度への応用はすべて十分に満足できるものではありません。

この研究では、CMV 検出のためのデジタル PCR (dPCR) を実行するために糞便上清から無細胞 DNA (cfDNA) を抽出する新しい方法を設計し、その性能を分析し、現在の手順で抽出された総 DNA と比較しました。 。

2 つの DNA 抽出法を使用した 22 対の便サンプルから、cfDNA 抽出法の方が DNA 濃度が著しく高く、遺伝子コピー数が制御されていることが証明され、CMV DNA セグメントの検出には cfDNA の方が有益で有用である可能性があることが示唆されました。 CMV DNA セグメントの検出における dPCR アプローチも、良好な直線性 (R2 = 0.997) とより高い感度 (50% での検出限界は 3.534 コピー/μL) を示します。 44 人の免疫不全患者からの 82 の便サンプルが分析されたところ、CMV 陽性率は 28% であり、これらの患者の胃腸症状の 4 分の 1 以上が CMV 感染または再活性化によって引き起こされている可能性があることが示されました。

総合的な結果は、便上清の cfDNA における dPCR による CMV の検出が CMV 胃腸炎を同定する強力な方法であり、臨床治療の意思決定に役立つことを示唆しています。

胃腸症状は、同種 HSCT を受けている患者などの免疫不全患者によく見られ、CMV 胃腸炎 [1] および/または胃腸 aGvHD [2] が原因である可能性が最も高いです。 CMV 胃腸炎または胃腸 aGvHD の診断のゴールドスタンダードは胃腸生検ですが、これは侵襲的処置であり、胃腸出血や穿孔などの重篤な副作用を引き起こす可能性があります [3、4]。 免疫不全患者の便サンプルからの qPCR による CMV DNA セグメント検出などの非侵襲的方法は、消化管生検に代わる可能性があると考えられています [5]。 しかし、便サンプル中の CMV DNA セグメント検出による CMV 胃腸炎の診断力については、十分に認められたコンセンサスが得られていません。 いくつかの研究では、CMV DNA セグメントを検出するための PCR ベースの便検査が、CMV 胃腸炎の診断 [6,7,8] または少なくともそれを除外する上で有用であることが明らかになりました [5, 9]。 他の研究では、糞便中の CMV 検出が CMV 腸炎の不適格な予測因子であることが示唆されています [10、11]。 注目すべきことに、DNA 抽出手順は便サンプル中の CMV 検出に重大な影響を与える可能性があります。 まず、便サンプルはさまざまな成分を含む複雑なマトリックスであり、DNA 抽出や PCR 反応に干渉する可能性があります [12]。 第二に、DNA 抽出手順により、製品の主な DNA タイプがトータル DNA であるか cfDNA であるかが決まりますが、これは CMV DNA セグメント検出の違いに関して十分に考慮されていません。

ゲノム DNA (gDNA) とは異なり、cfDNA は血清、尿、便の上清など、あらゆる体液に広く存在します。 近年、cfDNA 研究、特に非侵襲性早期癌診断と出生前スクリーニングの分野で多くの目覚ましい進歩が達成されました [13]。 cfDNA の配列決定は、肺移植後の感染および/または拒絶反応をモニタリングするためにも利用され、臨床結果と良好な一致を示しました [14]。 しかし、腸内 CMV 感染/再活性化の診断のために便サンプルから抽出された cfDNA 内の CMV DNA セグメントを検出することは、これまで十分に研究されていません。

DNA レベルを測定するためのゴールドスタンダード技術と考えられている定量 PCR には、標準曲線への依存や、特に標準や微量レベルの測定が欠如している領域での残存病変や潜伏期間が最小限に抑えられるなど、いくつかの欠点があります。ウイルス感染症。 デジタル PCR は、2011 年から商業的に利用可能な新しい技術であり、合成 DNA の希釈アッセイにおいて qPCR よりも優れた性能を発揮することが示されています [15]。 さらに、dPCR アプローチは、CMV 検出において qPCR アッセイよりも阻害傾向のある便サンプルに対して優れたパフォーマンスを発揮することも報告されています [16]。

ここでは、糞便サンプルからのさまざまな抽出方法に基づく CMV 検出に関する研究を報告します。 さらに、CMV DNA セグメント検出に使用される dPCR のパフォーマンスも評価されました。 我々は、dPCR による便 cfDNA 中の CMV の検出が感度が高く、免疫不全患者の腸管 CMV 感染症の診断に関連していることを示します。

この研究では、2017年から2020年までに、同種HSCTまたはキメラ抗原受容体T（CAR-T）細胞療法を受け、腹痛や下痢などの消化器症状が2週間以上続いた患者が登録された。華中科技大学同済医科大学同済病院倫理委員会 (TJ-IRB20180809)。 参加者からインフォームドコンセントを得た。 水様便の検体は滅菌容器に入れられ、収集後すぐに研究室に送られ、短期間 4 °C で保管され、収集後 8 時間以内に処理されました。

水様便サンプルを 300 メッシュ濾布で濾過し、サンプルを 3000 rpm で 10 分間遠心分離し、上清を取り出し、再度 10 分間遠心分離して有形成分を除去しました。 どちらの方法も 1 mL の糞便上清から開始しました。 無細胞 DNA と全 DNA は、それぞれ QIAamp Circulated Nucleic Acid Kit (カタログ番号 55114; Qiagen、Valencia、CA、USA) と QIAamp DNA Stool Mini Kit (カタログ番号 51504; Qiagen、Valencia、CA、USA) を使用して抽出されました。 、製造元の指示に従い、両方の溶出量は 25 μL でした。 DNA の濃度は、濃度が範囲外の場合、Qubit 蛍光光度計 3.0 (Qubit dsDNA HS Assay Kit; Invitrogen、Carlsbad、CA、USA) または NanoDrop 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) で測定しました。量子ビット蛍光光度計 (0 ～ 10 ng/μL)。 DNA サンプルは、試験実験にすぐに使用されるか、抽出後 -20 °C で保存されました。

CMV の IE1 (生得初期タンパク質遺伝子 1) の保存領域と参照遺伝子ヒト核 RNase P タンパク質 POP4 をターゲットとするプローブとプライマーは、Primer Express ソフトウェア バージョン 3.0.1 (Thermo Fisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用して設計されました。 Sangon Biotech Company (中国、上海) によって合成されました。 ＣＭＶプライマーの配列は以下の通りであった：フォワード５'−ＧＴＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＴ−３'、リバース５'−ＧＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＴ−３'、およびプローブ５'−ＦＡＭ−ＡＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＧＣＣＣ−ＭＧＢ−３'。 参照プライマーの配列は次のとおりでした：フォワード 5'-GGCGGTGGTCCTGGAGTACT-3'、リバース 5'-AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT-3'、およびプローブ 5'-VIC-ACCCGCCACAAGC-MGB-3'。 CMV および POP4 アンプリコンの長さは、それぞれ 64 bp および 68 bp でした。

dPCR アプローチは、以前に記載されているように実行されました [17]。 簡単に説明すると、10 μL 2× ddPCR スーパーミックス (dUTP なし、Bio–Rad、Hercules、USA)、プライマー (1 μL、10 μmol/L)、蛍光標識プローブ (2 μL、2.5 μmol/L)、 2 µL の DNA テンプレート（範囲 0.6 ～ 66 ng）を Quantalife QX200 Droplet Digital PCR システム（Bio-Rad、Hercules、USA）にロードし、反応混合物の全量は 20 µL でした。 QX200 液滴生成器を使用して 8 ウェル カートリッジで油中水滴を生成し、96 ウェルのポリプロピレン プレートに移し、ホイル紙で密封しました。 次に、プレートを ABI サーマルサイクラー (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) に置きました。 条件は次のとおりです: 95 °C で 5 分間、その後 95 °C で 30 秒間、60 °C で 1 分間を 40 サイクル (上昇速度は 2.5 °C/秒以下)、10 分間保持98 °C で、最終的に 4 °C で保持します。 PCR 後、結果を QX200 液滴リーダーで読み取り、製造元の指示に従って QuantaSoft ソフトウェア バージョン 1.7.4 で分析しました。 各反応は個別に分析され、必要に応じて閾値が手動で調整され、蛍光チャネルに個別に適合されました。 元のサンプルの最終コピー数の結果は、デフォルトで CMV DNA セグメントおよび参照遺伝子のコピー/mL として表示されました (追加ファイル 1、2、3、4、5、6、7)。

CMV標的配列をプラスミドベクターpUC57に接続して、定量的能力を試験するためのプラスミド標準を構築し、組換えプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換して増殖を完了させた。 EndoFree Plasmid Maxi Kit (カタログ番号 12362; Qiagen、Valencia、CA、USA) を使用して組換えプラスミドを抽出および精製し、NanoDrop 分光光度計で定量し、既知の濃度、分子量、およびアボガドロ定数を使用してコピー数を計算しました。 組換えプラスミドは、制限酵素 HindIII (カタログ番号 R0104S、NEB、米国) および BamHI (カタログ番号 R0136S、NEB、米国) によって直線化され、直線化されたプラスミド上の無傷の CMV 標的配列が保存されました。 約 10,000 コピー/μl ～ 3.2 コピー/μl の範囲の濃度で 5 倍段階希釈を行い、dPCR を行いました。 標準の各濃度を同じ条件下で 3 回繰り返し、定量的な直線性を決定しました。

エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) で抗凝固処理した全血検体 3 mL を収集し、3000 r/min で 5 分間遠心分離して、CMV-DNA 検出用の血漿 100 μL を採取しました。 血漿サンプルを処理し、HCMV PCR 蛍光定量検出キット (Daangene、広州、中国) の指示に従って CMV DNA を検査しました。

すべての統計分析は、統計ソフトウェア R v4.0.5 を使用して実行されました。 特定の状況では、一対のサンプルに対するウィルコクソンの符号付き順位検定、フィッシャーの直接確率検定、およびピアソンのカイ二乗検定が必要に応じて使用されました。

CMV DNA セグメント検出において DNA 抽出方法が重要であるかどうかを証明するために、2 つの DNA 抽出方法を使用して、一致する同一の便サンプル間で DNA 濃度とコントロール遺伝子のコピー数を比較しました。 cfDNA は、キット 1 とマークされた QIAamp Circulated Nucleic Acid Kit によって抽出されました。総 DNA は、キット 2 とマークされた QIAamp DNA Stool Mini Kit によって抽出されました。22 個の便サンプルが、さまざまな病気の患者から収集されました。臨床疾患と状態。 各サンプルは等量の 2 つの部分に分離され、cfDNA と全 DNA の抽出が別々に行われました。 驚くべきことに、同じ溶出量で、cfDNA の濃度はペアの全 DNA の濃度を大幅に上回りました (図 1A)。 次に、ペアのサンプルから抽出した cfDNA と全 DNA の両方でコントロール遺伝子のコピー数を検出したところ、コントロール遺伝子のコピー数は cfDNA の方が全 DNA 抽出物よりも著しく高いことがわかりました (図 1B)。 さらに、コントロール遺伝子は、合計 22 の DNA 抽出物のうち 3 つでは検出されませんでしたが、cfDNA 抽出物では検出されませんでした。 これらの結果は、DNA 抽出方法が DNA 抽出効率に顕著な影響を及ぼし、便サンプルなどの特殊なサンプルでは全 DNA よりも cfDNA の方が豊富であり、病原性微生物の検出に有用である可能性があることを示唆しています。

2 つの異なる抽出キットを使用して同じ便検体から抽出された cfDNA と総 DNA の一致した比較。 A 点は cfDNA と total DNA の濃度を表し、同じ標本から抽出された DNA サンプルは灰色の線で結ばれています。 B 点は DNA サンプル内の参照遺伝子のコピー数を表し、同じ標本から抽出されたものは灰色の線で結ばれています。

臨床サンプルに適用する前に、CMV と POP4 セグメントの両方を含むポジティブコントロールと POP4 セグメントのみを含むネガティブコントロールを使用して検証アッセイを実施し、CMV DNA と参照遺伝子を検出するためのプライマーとプローブの特異性をテストしました。 ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方がPOP4シグナルを持っていましたが、ポジティブコントロールのみがCMVシグナルを持っていました（図2）。 CMV DNA セグメント検出における dPCR アプローチのさらなる性能をテストするために、CMV DNA セグメントを含むプラスミドを 10,000 コピー/μL から 3.2 コピー/μL の濃度まで 5 倍連続希釈することにより、CMV DNA セグメント標準を確立しました。 予想通り、CMV DNA セグメントの測定コピー数は予測コピー数に非常に近かった (図 3A)。 測定されたコピー数の線形回帰の R 二乗は 0.997 でした。 LOD50 (50% での検出限界) は、陽性サンプルの半分が検出できる濃度を示します。 CMV DNA セグメント検出のための dPCR アプローチの LOD50 を決定するために、まず 5 倍段階希釈により 10,000 コピー/μL から 80 コピー/μL の標準濃度を調製し、次に 2 倍段階希釈を行って 40、 20、10、5、2.5、1.25、0.625、および0.313コピー/μL。

CMV DNA セグメント検出のネガティブおよびポジティブコントロールサンプル。 マゼンタの線は、陽性液滴と陰性液滴を区別するために設定された蛍光閾値を示します。 灰色の液滴は信号のない液滴です。 緑色の液滴は、POP4 の陽性シグナルを持つ液滴です。 青い液滴は、CMV DNA の陽性シグナルを持つ液滴です。 赤い液滴は、POP4 DNA と CMV DNA の両方のシグナルを持つ液滴です。 1 人の健康なドナーからのネガティブコントロール。 B すでに CMV 感染症と診断されている 1 人の患者ドナーからの陽性対照

dPCR による CMV DNA セグメント検出の性能評価。 検出された CMV DNA セグメントのコピー数と予測された CMV DNA セグメントのコピー数の比較。 X 軸は、標準の予測 CMV DNA セグメント コピー数を示します。これは、既知の濃度の CMV DNA セグメントを含む原液からの希釈度によって推定できます。 y 軸は、標準の正確に検出された CMV DNA セグメントのコピー数を示します。 それぞれの赤い三角形は 1 つの検出を表し、各希釈度は 3 つの赤い三角形に対応します。 緑色の線は最適な曲線を表します。 B 低濃度での CMV DNA セグメントの検出確率。 x 軸はプラスミド CMV DNA セグメントの濃度を示し、y 軸は検出確率を示します。 赤い三角形は、実験の総数を陽性に検出された実験の数で割ることによって計算された検出確率を表します。 緑色の線は最適な非線形フィット曲線を表します。

各標準サンプルを 8 回検査し、陽性検出率を計算しました。 非線形回帰は、0.98 の適合度 R 二乗で、さまざまな濃度での陽性率に対して行われました (図 3B)。 LOD50 は 3.534 コピー/μL と計算され、サンプル中の CMV DNA セグメント濃度がその値を超える場合、CMV は 50% 以上の確率で検出できました。

私たちは確立された dPCR アプローチを適用して、免疫不全患者の便サンプル中の CMV DNA セグメントを検出しました。 合計44人の患者が我々の研究に登録され、そのうち33人が同種HSCT療法を受けており、9人がCAR-T細胞療法を受けており、2人がCAR-T細胞と同種HSCT療法の両方を受けていた。 患者のうち11人は、最近Blood誌で報告された逐次CD19/22 CAR-T細胞免疫療法の臨床試験に参加した[18]。 患者の詳細な臨床的特徴を表 1 に示します。ベルベリンやモンモリロナイト粉末などの下痢止め薬の短期間の使用では制御できない腹痛と下痢の症状があったときに、これらの患者から 82 個の便サンプルが採取されました。 。 さまざまな原疾患を有する患者の便サンプルのCMV陽性率を分析しましたが、有意差は見つかりませんでした（図4A、フィッシャーの直接確率検定によるp = 0.81）。 異なる治療法によれば、CAR-T細胞療法または同種HSCT療法を受けた患者間のCMV陽性率も有意な差はありませんでした（図4B、フィッシャーの直接確率検定によるp = 1）。 合計の陽性率は 28% で、これらの免疫抑制患者の胃腸症状の 4 分の 1 以上が CMV 感染または再活性化によって引き起こされている可能性があることを示しています。

さまざまな患者またはサンプルグループにおける CMV 陽性サンプルと CMV 陰性サンプルの数。 A サンプルはさまざまな疾患の種類ごとにグループ化されています。 ヒストグラムは、正と負のサンプル比率組成を示します。 B 患者は、主な治療の種類、つまり同種 HSCT または CAR-T 細胞療法によってグループ化されます。 ヒストグラムは陽性サンプルと陰性サンプルの割合を示します

症例 1 (図 5A) は 16 歳の男性患者でした。 彼は2018年2月に急性リンパ性白血病と診断され、2018年12月に同種HSCTを受けた。造血幹細胞輸血の11日後、移植幹細胞が完全に移植された。 2ヵ月後、突然腹痛と下痢に襲われた。 CMV 胃腸炎の同定における血漿分析の有効性と便との適合性について疑問があったため、血漿分析を実施しました。 胃腸症状が発生した直後に血漿CMV DNAセグメントを検査したところ、結果は陰性でした。 2日後にcfDNAからの糞便CMV DNAセグメント検出も実施しましたが、陰性でした。 症状は 2 週間以上続き、鑑別診断には腸内視鏡検査が必要でした。 腸鏡検査による生検と腸組織からの CMV DNA セグメント検出により、aGvHD であることが裏付けられました。 抗免疫拒絶療法を 1 か月間受けた後、下痢の頻度は減りましたが、突然直腸出血が起こりました。 血漿および便中の CMV DNA セグメント検出は両方とも陽性であり、CMV 胃腸炎を強く示唆しました。 したがって、治療の焦点は抗ウイルス療法に移りました。 抗ウイルス治療の 1 週間後、CMV DNA セグメントは血漿サンプルでは検出できませんでしたが、便サンプルでは依然として高いコピー数を維持していました。 抗ウイルス治療から 1 か月後、血漿サンプルと便サンプルの両方で CMV DNA セグメントは陰性でした。 同時に胃腸症状も徐々に消失した。 CMV DNA セグメントをモニタリングしたところ、1 か月以上陰性でした。

2 つの典型的なケースでは、治療に伴って血漿と便の両方で CMV DNA セグメントのコピー数が変化します。 A この事例は、CMV DNA セグメントが便中では陽性であるが、同時に血漿中では陰性である可能性があることを示しています。 B この事例は、CMV DNA セグメントが血漿中では陽性であるが、同時に便中では陰性である可能性があることを示しています。

症例 2 (図 5B) は、同種 HSCT 療法を受ける前に 2 か月間重度の再生不良性貧血を患っていた 8 歳の少女でした。 移植された幹細胞は、幹細胞注入の 11 日後に完全に移植されました。 ほぼ 3 か月後、持続的な下痢の症状が現れ、最初は血漿サンプルと便サンプルの両方で CMV DNA セグメントが陰性でした。 電子腸内視鏡検査では、結腸粘膜全体にびまん性のうっ血と浮腫が示され、腸粘膜では CMV と EBV の両方が陰性でした。 その後、血漿および便中に CMV DNA セグメントが陽性検出されるまで、3 週間以上強化された免疫抑制治療を受けました。 1週間後にCMV DNAセグメントが便中で陰性になったため、抗ウイルス治療は1週間続きました。 1 か月後、血漿 CMV は再び陽性となり、1 か月以上陽性を維持しましたが、便中の CMV DNA セグメントは期間を通じて陰性でした。 強化された免疫抑制治療と抗ウイルス治療の両方により、彼女は 2 か月後にようやく下痢から回復しました。

同種 HSCT と CAR-T 細胞療法はどちらも血液悪性腫瘍にとって歴史的に重要です。 同種HSCTまたはCAR-T細胞療法を受けている患者は、胃腸の不快感、CMV感染または再活性化、およびaGvHDを患っていることがよくありますが、これらは一般的な重篤な合併症であり、区別するのが困難です。 さらに、これらの合併症はまったく異なる治療法で対処されるため、診断が不確実であると治療に重大な課題が生じます。 従来の検査は内視鏡下での消化管生検であり、これは重篤な副作用を引き起こす可能性がある侵襲的な手術です。 CMV 胃腸炎を診断し、他の消化管疾患を区別するには、代替サンプルと検出方法が必要です。

感染の予測または診断に cfDNA を利用することは、所要時間と精度の点で、培養ベースの方法などの従来の戦略よりも優れているようです [14、19、20]。 シーケンスベースの方法は現在臨床で広く使用されており、広範囲の病原体検出が可能ですが、依然として若干高価で時間がかかるという欠点があります。 特定の病原体検出の場合、PCR ベースの方法は効率と感度の両方で利点があります。 血清や血漿と比較すると、大便サンプルは、大量の細菌バックグラウンドと PCR 抑制物質が含まれているため、独特です。 したがって、PCR ベースの方法は他の病原体からの干渉を最小限に抑えることができるため、このようなサンプルには非常に適しています。

以前の研究では、DNA 抽出キットが DNA の品質、特にグラム陽性に関する細菌の組成に明確な影響を与えることが報告されています [21]。 著者らは、これは異なる抽出キットによるグラム陽性菌の溶解効率に起因すると考えた。 CMV 胃腸炎の診断のための CMV 検出の報告をスクリーニングしたところ、便サンプル中の CMV DNA セグメント検出の診断能力に関して明らかに矛盾する意見が見つかりました。 興味深いことに、CMV 検出は CMV 胃腸炎の診断に不十分ではないと結論付けた 2 つの報告では、同じ抽出キットである QIAamp DNA Stool Mini Kit が使用されていました。 このキットは主に、便サンプル中の溶解細胞から gDNA を単離しました。 しかし、腸上皮細胞があまり解離しなかった場合、または便処理前に無傷の細胞構造を維持できなかった場合、CMV DNA セグメントは、たとえ実際には細胞内に存在していても、最終的な DNA 抽出には存在しませんでした。 この仮定に基づいて、同じ便サンプルから抽出した cfDNA と総 DNA を比較しました。 DNA 濃度は全 DNA よりも無細胞 DNA の方がはるかに高く、対照遺伝子のコピー数も無細胞 DNA の方が全 DNA よりも高いことがわかりました。 この結果は主に、胃腸炎が発生したときに腸上皮細胞が広範囲に溶解、アポトーシス、または活発に分泌され、無傷の細胞がほとんど脱落せずに無傷DNAが便中に放出されたという事実によって説明できます。

CMV の定量的検出における dPCR と qPCR の比較が報告されており、qPCR の感度が dPCR より若干高いことが示されています [22]。これは、dPCR アプローチの最適化範囲によって混乱する可能性があります。 当センターの最近の出版物 [17] では、dPCR アッセイと qPCR アッセイには標準サンプルと臨床サンプルの両方で良好な相関関係があるが、dPCR の方が再現性と再現性が優れていることが示されました。 さらに重要なことは、2 つの方法が完全に最適化されている場合、dPCR アプローチの検出限界は qPCR の検出限界よりも低かったことです。 そこで、dPCR ベースの CMV DNA セグメント検出手法を開発し、性能評価を行ったところ、検出範囲において非常に高い精度を有することがわかりました。 高い特異性を考慮して、標準の LOD50 を測定することで感度もテストしました。LOD50 は 3.534 コピー/μL (3534 コピー/mL) でした。 Haydenらの研究。 彼らの LOD は WHO 基準で 4571 コピー/mL であると明らかにしました [22] が、私たちはほぼ同じレベルでした。 今後、DNAテンプレートのローディング量、プローブとプライマーの濃度、PCR反応条件などのさらなる最適化が行われる可能性があります。

CMV 感染または再活性化は、同種 HSCT を受けている患者において広く研究されていますが、CAR-T 細胞療法を受けている患者における十分な臨床データはありません。 著者らの知る限り、これは同種HSCTおよびCAR-T細胞療法を受けている患者におけるCMV感染率または再活性化率を比較した最初の報告である。 Stewart [23]は、CAR-T細胞療法の感染性合併症を要約し、予防を受けていない患者でもCMVの再活性化はまれであることを発見した。 我々のデータは、CMV感染率または再活性化率がCAR-T細胞療法を受けている患者と同種HSCTを受けている患者で同様であったことを明らかにしている。 CMV 陽性率は、それぞれ、CAR-T 細胞療法を受けている患者のサンプルでは 30.0% (3/10)、同種 HSCT を受けている患者のサンプルでは 28.6% (20/70) でした。 我々の研究における患者とサンプルの選択はCAR-T細胞臨床試験において不偏ではなかったので、実際のCMV感染率または再活性化率はコホート全体でより低いはずです。 それにもかかわらず、CMV 感染または再活性化によって引き起こされる胃腸症状は、同種 HSCT または CAR-T 細胞療法を受けている患者では珍しいものではないと推測できました。 また、CMV 感染率または再活性化率と、同種 HSCT または CAR-T 細胞療法を受けてからの時間との関係も評価しました。 予想通り、胃腸症状のある患者では、CMV 感染または再活性化率は時間の経過とともに明確な傾向を示さなかったが、これは持続的な免疫抑制状態によって説明できる可能性がある。

CMV 感染または再活性化を検出するために便サンプルを血漿サンプルに置き換えることができるかどうかを明らかにするために、便サンプル中の CMV DNA セグメントのコピー数と、同時に採取された対応する血漿サンプル中の CMV DNA セグメントのコピー数を比較し、2 つの特殊なケースを詳細に説明しました。問題。 2 つの標本の検出結果はよく一致しておらず、相互に表現できないことがわかりました。 したがって、CMV 関連の胃腸疾患が疑われる場合は、血漿では CMV DNA セグメント検出が陰性である可能性が高いため、血漿ではなく便サンプルを検査する必要があります。 さらに、便サンプルからの CMV 負荷モニタリングは、CMV 腸炎診断のゴールドスタンダードと考えられている腸生検と比較して、かけがえのない利点を示しました。 まず、これは非侵襲的な検出方法であり、患者を余分な危害や感染リスクから保護します。 第二に、便利で経済的であり、状態の変化を監視するために頻繁かつ継続的な検出が可能です。 2 つの症例から、胃腸症状は CMV 感染または再活性化によって引き起こされるのではなく、その後の CMV 感染または再活性化を伴う可能性があり、それが常に状態をより複雑にすることがわかりました。 したがって、CMV 負荷モニタリングは、診断の明確化と医療上の意思決定の両方においてより重要です。

結論として、便上清の cfDNA における dPCR による CMV の検出は、CMV 胃腸炎を同定するための強力な方法であり、より高い効率と感度を示し、臨床治療の意思決定に役立ちます。

データと資料は、責任著者からの合理的な要求に応じて入手できます。

サイトメガロウィルス

同種造血幹細胞移植

急性移植片対宿主病

無細胞 DNA

デジタル PCR

定量的ポリメラーゼ連鎖反応

ゲノムDNA

キメラ抗原受容体T細胞

先天性初期タンパク質遺伝子 1

検出限界50

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この研究にご貢献いただいた参加者の皆様に感謝いたします。

この研究は、中国国家自然科学財団の総合プログラム (番号 82000189) によって支援されました。

華中科学技術大学同済医科大学同済病院血液内科、No. 1095 Jiefang Avenue、武漢、430030、湖北省、中国

Jia Gu、Hongyan Ji、Tongyuan Liu、Caixia Chen、Siye Zhao、Yang Cao、Na Wang、Min Xiao、Liting Chen、Haodong Cai

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JG; HJ; TL; CC と SZ が実験を実施してデータを分析し、JG と HC が原稿を執筆し、YC と NW が患者の世話をして臨床情報を提供し、LC が研究の構想を提案して研究を指揮し、MX と HC が原稿を監督しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Haodong Cai への通信。

人間の参加者を含む研究は、華中科技大学同済医科大学同済病院の倫理委員会によって審査され、承認されました（TJ-IRB20180809）。

著者全員が原稿の出版を承認しました。

著者らは利益相反はないと宣言しました。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

dMIQE2020 チェックリスト。

dMIQE のサポート情報と補足方法。

dPCR オリゴヌクレオチドの設計とターゲット情報の詳細。

dPCR プラットフォームと反応システムの詳細。

この研究の数値に関するアッセイの検証とデータ分析の詳細。

肯定的な実験結果と否定的な実験結果の例。

入力 DNA (cfDNA) 濃度と参照遺伝子 POP4 のコピー数の間の相関関係。

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転載と許可

Gu、J.、Ji、H.、Liu、T. 他。 CMV 胃腸炎の非侵襲的診断のための、便サンプル中のデジタル PCR によるサイトメガロウイルス (CMV) の検出。 Virol J 19、183 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12985-022-01913-z

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受信日: 2022 年 7 月 16 日

受理日: 2022 年 11 月 1 日

公開日: 2022 年 11 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01913-z

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